羊駝與奈米抗體
By Helen Wong 王思齊
談及羊駝，我們通常會想到假日農場或羊駝絨，但如果你問生物醫學範疇的科學家的話，他們卻可能會想起一種特殊抗體的片段 — 奈米抗體。
要明白奈米抗體的特殊之處，我們須先了解抗體的結構（圖一）。傳統抗體是由兩條重鏈和兩條輕鏈通過二硫鍵連接形成的 Y 形分子。Y形抗體的兩個尖端稱為可變區，負責與目標抗原結合。一如其名，可變區可以有不同的變化，它們決定抗體與甚麼抗原結合。除傳統抗體外，羊駝、駱駝和駱馬等駱駝科動物也會製造一種僅由兩條重鏈組成的特殊抗體 [1, 2]，而奈米抗體就是這些特殊抗體的可變區。
圖一 (a) 傳統抗體、(b) 駱駝科動物只有重鏈的抗體及(c) 奈米抗體（L：輕鏈、H：重鏈、灰色：可變區、紫色：恆定區）
在1993年發現奈米抗體後不久，科學家便注意到它的巨大潛力 [1]。這些抗原結合域（與抗原結合的部分）不但有著非凡的專一性、穩定性和溶解度，它們的大小也只有傳統抗體的十分之一 [3]，以上特性均使奈米抗體有望成為新一代藥物和顯影劑……等等，怎樣才能生產我們想要的奈米抗體呢？
你心中或許已有答案。是的，就是羊駝（儘管透過其他駱駝科動物來生產奈米抗體也行）！在典型的篩選過程中 [4]，科學家會透過注射不同抗原，誘導羊駝的 B 細胞產生相應的抗體。在提取B細胞及其mRNA後，科學家會把mRNA反轉錄成雙鏈的互補DNA（cDNA / complementary DNA），然後在聚合酶鏈反應（PCR / polymerase chain reaction）中使用專門設計的引物複製可變區的 DNA 序列。接著，科學家會將攜帶不同可變區序列的重組質粒引入噬菌體（病毒的一種），使它們在其表面表達相應的奈米抗體。有些噬菌體表面會表達能與目標抗原結合的奈米抗體，所以最後一步就是挑出這些噬菌體，並以 DNA測序法找出目標奈米抗體的DNA序列。有了這項資訊，我們就可以對大腸桿菌（Escherichia coli）進行基因改造，大量生產所需的奈米抗體 [5]。
對癌症患者來說，找出癌組織在體內的分佈對診斷和後續治療至關重要。要以正電子放射斷層掃描（PET / positron emission tomography）拍攝腫瘤組織，我們需要一種可被檢測的放射性追蹤劑（探針），它應能專一地與目標腫瘤抗原結合。毫無疑問，具有高度專一性的奈米抗體正是理想的探針。為了使奈米抗體得以被探測，科學家提出了一個巧妙的解決方案，就是以氟-18或鋯-89等放射性同位素標記奈米抗體 [6]。奈米抗體比傳統抗體的優勝之處在於體積細小，這讓奈米抗體得以輕鬆穿透腫瘤組織，從而揭示更多隱藏的癌細胞。
奈米抗體跟傳統抗體一樣，也能用於治療用途。在2020年，瑞典科學家報告了一項激動人心的發現：一種羊駝製造的奈米抗體可以通過阻斷SARS-CoV-2與宿主細胞受體的相互作用來中和新型冠狀病毒，從而阻止病毒進入和感染宿主細胞 [7]。奈米抗體也有望成為新一代癌症療法。事實上，科學家一直在開發針對結腸癌、乳癌和肝癌的奈米抗體藥物 [4]，他們相信這些藥物能阻斷重要的癌細胞信號，或在化療和放射治療中作為載體，運送藥物分子及放射性化合物到腫瘤組織以消滅癌細胞。
除了在疾病相關的應用外，科學家們亦在活細胞成像（live cell imaging）中使用奈米抗體。透過將羊駝奈米抗體與綠色螢光蛋白融合，研究人員便能實時觀察目標蛋白在免疫反應中的作用 [8]。結構生物學家也對奈米抗體深感興趣，他們在奈米抗體的幫助下通過 X 射線晶體學（註一）和冷凍電子顯微鏡（註二）來確定蛋白質結構 [9-11]。
奈米抗體絕不只有上面提及的用途，直至今天，科學家仍在積極探索奈米抗體的其他應用。各位讀者，當你與家人朋友一起參觀羊駝農場時，別忘了和他們分享這些可愛生物的奇妙之處！
1 X射線晶體學（X-ray crystallography）：一種用於找出結晶樣本三維分子和原子排列的常用技術。樣本會被暴露在 X 射線下，產生的 X 射線衍射圖可用於確定樣本的結構。然而，準備結晶樣本的過程具有一定挑戰性，奈米抗體正正能用於增加結晶成功率 [10]。
2 冷凍電子顯微術（Cryo-electron microscopy; cryo-EM）：使用傳統透射電子顯微術時，生物分子可能會被高能量的電子燃燒或破壞，而冷凍電子顯微術則使用冷凍樣本和強度較低的電子束 [12]。過去研究小蛋白質（<100 kDa）在技術上極具挑戰性，但現在奈米抗體能讓結構生物學家通過冷凍電子顯微術研究小蛋白質 [11]。
參考資料：
[1] Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 1993;363(6428):446-448. doi:10.1038/363446a0
[2] Muyldermans S. Single domain camel antibodies: Current status. Reviews in Molecular Biotechnology. 2001;74(4):277-302. doi:10.1016/s1389-0352(01)00021-6
[3] Salvador J-P, Vilaplana L, Marco M-P. Nanobody: Outstanding features for diagnostic and therapeutic applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2019;411(9):1703-1713. doi:10.1007/s00216-019-01633-4
[4] Sun S, Ding Z, Yang X, et al. Nanobody: A Small Antibody with Big Implications for Tumor Therapeutic Strategy. International Journal of Nanomedicine. 2021;16:2337-2356. doi:10.2147/ijn.s297631
[5] de Marco A. Recombinant expression of nanobodies and nanobody-derived immunoreagents. Protein Expression and Purification. 2020;172:105645. doi:10.1016/j.pep.2020.105645
[6] Yang EY, Shah K. Nanobodies: Next generation of cancer diagnostics and therapeutics. Frontiers in Oncology. 2020;10:1182. doi:10.3389/fonc.2020.01182
[7] Hanke L, Vidakovics Perez L, Sheward DJ, et al. An alpaca nanobody neutralizes SARS-COV-2 by blocking receptor interaction. Nature Communications. 2020;11(1):4420. doi:10.1038/s41467-020-18174-5
[8] Schmidt FI, Lu A, Chen JW, et al. A single domain antibody fragment that recognizes the adaptor ASC defines the role of ASC domains in inflammasome assembly. Journal of Experimental Medicine. 2016;213(5):771-790. doi:10.1084/jem.20151790
[9] Domanska K, Vanderhaegen S, Srinivasan V, et al. Atomic structure of a nanobody-trapped domain-swapped dimer of an amyloidogenic Β2-microglobulin variant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2011;108(4):1314-1319. doi:10.1073/pnas.1008560108
[10] Koide S. Engineering of recombinant crystallization chaperones. Current Opinion in Structural Biology. 2009;19(4):449-457. doi:10.1016/j.sbi.2009.04.008
[11] Wu X, Rapoport TA. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the National Academy of Sciences. 2021;118(41):e2115001118. doi:10.1073/pnas.2115001118
[12] Broadwith P. Explainer: What is cryo-electron microscopy. Chemistry World. https://www.chemistryworld.com/news/explainer-what-is-cryo-electron-microscopy/3008091.article.